9月6日，首个国家亚健康干预技术成果应用中心落户长沙麓谷,国家中医药管理局亚健康干预技术实验室隶属于国家中医药管理局，是国内唯一从事亚健康干预技术研究的专业机构，拥有以国家973项目主持人、教育部新世纪优秀人才为核心的研究团队，专业从事亚健康干预技术的研究。2012年9月，该实验室主任刘东波教授当选为联合国亚太亚健康干预技术联盟主席，以“未病防病、既病防变、愈后防复”为目标，对慢性非传染性疾病提出心理、行为、膳食和营养干预方案，并于2016年成立了国家中医药管理局亚健康干预技术实验室糖尿病干预中心。糖尿病作为实验室创立后的一个重要的慢性病研究对象，历经长期研究，独创了国内第一套糖尿病中医营养干预技术。

刘东波教授文献当中分享了国家中医药管理局亚健康干预技术实验室糖尿病干预中心研究成果。他指出，糖尿病中医营养干预技术就是以三低三高（低血糖负荷、低卡路里、低碳水化合物和高不饱和脂肪酸、高膳食纤维、高药食同源）的饮食模式和间歇性禁食方式治疗糖尿病，以科学的方法为导向，重点教会糖尿病病人正确的健康生活方式，教会他们自我管理血糖的方法，逐步实现恢复胰岛功能，重新夺回控制血糖的主动权，帮助广大糖尿病患者控制病情发展的问题，有利于糖尿病患者科学的自我管理，达到改善健康状况或治疗疾病的目标。

以下是刘东波教授的文献：

GLP1R-GFP稳定转染 Rin-m5F 细胞系的构建

胡涌泉 1，2 ，曾璐漫 2，6 ，吴艳阳 2，5 ，魏云林 7 ，刘东波 1，2，3，4* 

（1. 湖南农业大学园艺园林学院，长沙　410128；2. 国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，长沙　410128；3. 湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，长沙　410128；4.湖南省植物功能成分利用协同创新中心，长沙410128；5. 湖南农业大学食品科学技术学院，长沙　410128；6. 湖南应用技术学院，湖南　常德415100；7. 昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明　650500）摘要：目的　本研究目的是构建一种能稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）人胰高血糖素样肽 -1 受体（GLP1R）的胰岛细胞系，用来筛选 GLP1R 激动剂类药物。方法　使用 X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent将 pCMV6-AC-GLP1R-GFP 质粒转染到 Rin-m5F细胞，经 G418 筛选单克隆 Rin-m5F/GLP1R-GFP 细胞并扩大培养。结果　该细胞能稳定传代，荧光显微镜下观察细胞绿色荧光分布均匀，Western blot验证 GLP1R 蛋白表达显著增加。在实验验证中，对照空白组中细胞绿色荧光分布均匀，阴性药物格列本脲（非 GLP1R 靶点药物）作用时细胞内无明显荧光斑点出现，阳性药物百泌达作用（GLP1R 激动剂类药物）时细胞内出现显著荧光斑点。结论　GLP1R 激动剂类药物筛选模型 Rin-m5F/GLP1R-GFP 成功构建。该模型能对混合物样品进行筛选，具有假阳性极低、筛选所需样本小、筛选样品量大、易标准化、筛选速度快、特异性强等优势，为 GLP1R 激动剂类药物的筛选奠定了基础。

关键词：人胰高血糖素样肽 -1 受体；Rin-m5F；质粒转染

中图分类号：R739.4　　　　文献标识码：A　　　　文章编号： 1672-2981(2017)06-0785-05doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2017.06.018Construction of GLP1R-GFP stably transfection Rin-m5F cell linesHU Yong-quan 1, 2 , ZENG Lu-man 2, 6 , WU Yan-yang 2, 5 , WEI Yun-lin 7 , LIU Dong-bo 1, 2, 3, 4* (1. Horticulture andLandscape College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128; 2.State Key Laboratory of SubhealthIntervention Technology, Changsha410128; 3. Hunan Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation andUtilization, Hunan Agricultural University, Changsha 410128; 4. Hunan Co-Innovation Center forUtilizationof Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128; 5. College of Food Science and Technology, HunanAgricultural University, Changsha 410128; 6. Hunan College of Applied Technology, Changde Hunan 415100;7. Faculty of Life Sciences and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500)Abstract: Objective To establish a new method to screen glucagon like peptide-1 receptor (GLP1R) agonists.Methods The pCMV6-AC-GLP1R-GFP plasmid was transfected into Rin-m5F cells byX-tremeGENE HPDNA transfection reagent. Monoclonal Rin-m5F/GLP1R-GFP cells were screened by G418. The fluorescencespots were observed by fluorescence microscope. GLP1R expression was de tected by Western blot. ResultsThese cells were passaged normally with stable green fluorescence, and the expression of GLP1R protein wassignificantly increased. The green fluorescence of the control group was dispersive, and the Glibenclamide

(non GLP1R target drugs) treatment group did not show distinct fluorescence spots, while the Byetta (GLP1Ragonists) treatment group showed lots of fluorescence spots (activation of GLP1R). Conclusion Rin-m5F/GL-P1R-GFP, the model for GLP1R agonist screening, has been successfully constructed. This model is rapid and基金项目：国际科技合作与交流专项（No.2013DFG32060）。

作者简介：胡涌泉，男，在读硕士研究生，主要从事细胞生物学、分子营养研究，E-mail：bookhulai@sina.cn　 * 通讯作者：刘东波，男，教授，博士研究生导师，主要从事亚健康干预基础和应用技术研究，Tel：（073184617244，E-mail：chinasaga@163.com786Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6　中南药学 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期糖尿病是由遗传因素、病毒感染、自由基毒素、细胞因子等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退，肝脏、骨骼肌、脂肪组织等发生胰岛素抵抗进而引发的一系列代谢紊乱综合征[1-4] 。临床上以高血糖（空腹血糖＞ 7.0 mmol·L－ 1 ，餐后血糖＞ 11.1mmol·L－ 1 ）为主要特点 [5] 。糖尿病患者组织器官长期处于高血糖状态会引发诸多并发症，导致心脑血管、肝、肾眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈[6-8] 。胰 高 血 糖 素 样 肽 1（GLP1） 因 与 GLP1 受 体（GLP1R）结合后可刺激胰岛素分泌并抑制胰高血糖素分泌，已成为近些年糖尿病药物开发的重要靶点[9] 。已有的 GLPlR 激动剂类药物均属于大分子多肽类，不能口服给药，长期服用会产生诸多不良反应，且保存与运输条件要求严苛[10-11] 。因此需要寻找不良反应少且疗效长期稳定的 GLP1R 小分子激动剂药物。目前基于 GLPlR 为靶点构建的高通量 GLP1 激动剂筛选模型主要从受体与配体结合、检测胞内第二信使 cAMP、构建受体功能反应报告基因三个方面进行[12] 。但这些筛选模式假阳性高、筛选时间长、筛选效低，严重制约了 GLP1 类似物小分子药物的开发。因此建立筛选 GLPlR 激动剂模的研究变得尤为迫切。本文研究目的是建立一种新的 GLPlR 激动剂类药物筛选方法：构建稳定表达绿色荧光蛋白人 GLP1R 细胞模型 Rin-m5F/GLP1R-GFP并通过阳性药物百泌达、阴性药物格列本脲验证该模型应用于 GLPlR 激动剂类物筛选的效果。

1　材料

1.1　细胞

株大鼠胰岛素瘤细胞株（Rin-m5F）（上海通派生物科技有限公司）。

1.2　试药

pCMV6-AC-GLP1R-GFP 质粒（湖南农业大学刘东波教授惠赠），RMPI 1640 培养基（Gibco），胎牛血清（BI），谷氨酰胺（TransGen），0.25%EDTA- 胰酶（TransGen），X-tremeGENE HP DNA TransfectionReagent（Roche）G418（Sigma），防荧光淬灭封片剂（Southern Biotech），多聚甲醛（Sigma），GLP1R抗体（Abcam），GAPDH 抗体（Yataihengxin），羊抗小鼠 IgG1 二抗（Southern Biotech），羊抗兔 IgG1 二抗，一次性过滤器（Millex），一次性注射器（上海治宇），圆形盖玻片、载玻片（世泰），细胞培养板（Corning）等。

1.3　仪器  

CO 2 恒温细胞培养箱（美国 SHELLAB），倒置显

微镜（上海荼明光学 BXP-106），倒置荧光显微镜（日本 OLYMPUS），激光共聚焦荧光显微镜（Zeiss LSM710），超净工作台（苏州净化设备有限公司，SW-CJ-IFD），Countess 自动细胞计数仪（Life Technologies），电子天平（型号 JL3003，JENNER），超纯水仪（Milli-RO Plus，millipore）等。