2、方法

2.1　细胞培养

细胞复苏后置于 25 cm 2 培养瓶中，在 37℃，5%CO 2 条件下培养，具体方法见参考文献[13] 。

2.2　转染及其体系优化

① 取对数生长期 Rin-m5F细胞消化成单个的细

胞悬液，均匀接种于 6 孔板中，设置细胞密度分别为2×10 5 、4×10 5 个·mL－ 1 ，CO2 培养箱过夜培养；

②根据转染试剂说明书上推荐的使用浓度制备转染溶液，质粒（μg）∶转染试剂（μL）分别为 1∶2、1∶3、1∶4。取 2.5 μg pCMV6-AC-GLP1R-GFP 质 粒 溶 于 97 μL无血清 RMPI 1640 培养基中，轻轻来回混匀，室温静置5 min，使质粒与培养基充分混匀；再按照比例相应加入转染试剂，轻轻来回混匀，室温静置 40 min，使混合物充分混匀；

③ 弃掉 6 孔板中的培养基，用 PBS 洗2 遍，每孔加入 2 mL新鲜完全培养基；

④ 在转染组逐滴加入转染溶液，边加边晃动 6 孔板，使转染液与细胞培养基充分混匀。

⑤ 标记好空白组及对照组，将细胞放入 CO 2 细胞培养箱中，37℃、5%CO 2 培养24 h；

⑥倒置荧光显微镜下观察，随机选取视野并拍照。运用软件 Image-Pro-Plus 6.0 统计细胞数目，计算转染效率；

⑦ 去掉转染溶液，PBS 洗 2 遍，加入新鲜完全培养基恢复培养 2 d，备用。

2.3　优化 G418 筛选浓度

① 取对数生长期 Rin-m5F细胞消化成单个的细胞悬液，均匀接种于 24 孔板中，过夜培养。

② PBS 洗2 遍，更换新鲜培养基，按下面浓度加入 G418 溶液：1000、600、200、100、50、0 μg·mL －1 。

③ 按照步骤②中 G418 浓度梯度，每 2 日更换 1 次新鲜培养基（含 G418），连续培养观察 14 d。若孔内细胞大量死亡，则该孔 G418 减半筛选；若孔内细胞已全部死亡，则该孔停止加入 G418 溶液。每日在倒置显微镜下观察细胞死亡情况。

④ 将“2.2”项下恢复培养 2 d 后转染组的细胞，加入 1 mg·mL －1 G418 溶液培养 2 d，PBS 洗 2 遍，更换新鲜培养基继续培养，每日观察细胞生长情况。

2.4　筛选单克隆细胞株

① 按照“2.2”项下最佳转染体系转染细胞，24 hefficient for screening GLP1R agonists, owint to its advantage of admixture-screening, high throughput, lowfalse positive rate, fewer samples needed and ease of application comparing to the traditional screening model.Key words: glucagon like peptide-1 receptor; Rin-m5F; plasmid transfection787

中南药学 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期　Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6后去转染液，PBS 洗 2 遍，更新 2 mL新鲜培养基，37℃、5%CO 2 恢复培养 2 d。

② 加入 G418，筛选转染细胞。按“2.3”项下筛选得到的 G418 浓度，先选用使细胞大量死亡的浓度，然后更换小浓度 G418 继续筛选。

③ 每日在倒置荧光显微镜下观察，当转染组中未被转染的细胞全部被杀死，则停止 G418 筛选。

④PBS 洗 2 遍，更换新鲜培养基，37℃、5%CO 2 培养，至绿色荧光细胞出现单克隆团细胞。期间根据培养基颜色及细胞状态及时更换新鲜完全培养基。

⑤ 采用梯度稀释法筛选单克隆细胞株：将转染组中孔内的细胞用胰酶消化，弃掉胰酶，加入 1 mL新鲜完全培养基将细胞吹打成单个的细胞悬液。按照 10 倍稀释法，将细胞加入 96 孔板中依次进行稀释，直至孔内细胞浓度为 1 ～ 2 个每 100 μL。

⑥ 每日置于倒置荧光显微镜下观察，根据实际情况为细胞更换新鲜完全培养基。

⑦当 96 孔板内细胞密度达到 30%时，消化细胞移入 24孔内扩大培养。

⑧ 当 24 孔板内细胞密度达到 80%以上时，消化细胞移入 T-25 细胞培养瓶中扩大培养。

⑨冻存细胞，备用。

2.5　Western blot检验

在 6 孔板内分别接种相同数目的 Rin-m5F野生型细胞和步骤“2.4”项下获得的Rin-m5F/GLP1R-GFP单克隆细胞株，在完全培养液中培养至细胞密度长至90%左右。PBS 洗 2 遍，每孔加 200 μL2%SDS 裂解液，收取蛋白样品。置于 100℃水浴 10 min，加入 40μL的 6× 上样 Buffer稀释，置于 100℃水浴 10 min。Western blot实验方法见参考文献[14] 。

2.6　模型验证

实验分为空白对照（完全培养基）、溶剂对照（培养基加入 1%PBS、1%酒精、1%DMSO）、阳性对照（GLP1R 靶点药剂，百泌达）、阴性对照（非 GLP1R靶点药剂，格列本脲）。不同浓度药物处理相同时间：浓度设置为 0.25、0.5、2.5、5 μg·mL－ 1 ，均处理 1 h。相同浓度药物处理不同时间：药物浓度为 0.25μg·mL－ 1 ，分别处理 10、20、40、120 min。

操作流程：

① 将无菌圆形玻片在酒精灯火焰上来回灼烧数次，冷却后平铺在 24 孔板内，每孔一片；

②取“2.4”项下获得的单克隆细胞 Rin-m5F/GLP1R-GFP接种于圆形玻片上，轻轻摇晃培养板，使细胞均匀分布在板内，过夜至细胞密度长至 85%以上；

③ PBS 洗2 遍，加入含不同浓度药物的培养基 37℃孵育不同时间；

④ 吸弃培养液，PBS 洗 3 遍。加入 500 μL 4%多聚甲醛固定细胞 10 min，吸弃，PBS 洗 3 遍；

⑤ 取洁净载玻片，滴加 20 μL防荧光淬灭粘片剂，用镊子轻轻夹起圆形玻片，轻轻倒扣在防荧光淬灭粘片剂上，防止气泡产生；

⑥ 将玻片置于暗室通风干燥过夜，制好的玻片于激光共聚焦荧光显微镜下观察并拍照。

2.7　数据统计与分析

采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析。数据以均数 ± 标准差（x±s）表示，组间采用单因素方差分析，各组均数都采用 LSD（Least-significant differencetest）检测，若 P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

3、结果

3.1　细胞形态观察

细胞 Rin-m5F复苏时在显微镜下观察，细胞基本呈单个、圆形均匀分布在新鲜完全培养基内，细胞密度为 50%左右，培养基中无明显杂质。过夜培养后，细胞贴壁率为 90%以上，细胞轮廓清晰、多呈不规则形状分布，多呈岛状聚集铺开生长。经胰酶消化，显微镜下观察显示细胞逐渐变圆，细胞间开始出现间隙。吹打成单个以 1∶3 传代至 3 代时，细胞形态正常、生长速率恢复到最佳，每 2 ～ 3 日即可传代（见图 1）。

图 1　Rin-m5F细胞显微镜观察图（200×）

Fig 1　Micro-observation of Rin-m5F cell lines（200×）

3.2　转染及其体系优化

转染时在细胞接种量、质粒∶转染试剂 2 个方面进行优化，转染 24 h 后，倒置荧光显微镜下观察转染成功的细胞整个分布绿色荧光、荧光强度不一。拍照、统计转染效率分别见表 1。

表 1　转染效率Tab 1　Transfection efficiency

3.3　选择合适的 G418 筛选浓度

加入各浓度 G418 培养细胞，每日在倒置显微镜下观察细胞生长状态。观察得到 10 ～ 14 d 最低浓度至全部细胞死亡的 G418 浓度为 100 μg·mL －1 。但是Rin-m5F细胞在 G418 作用 48 h 后，浓度 1 mg·mL －1组的细胞基本全部死亡。Rin-m5F细胞转染组在 1788Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15No.6　中南药学 2017 年 6 月 第 15 卷 第 6 期mg·mL －1 G418 中培养 48 h 后，未转染的细胞大量死亡，转染成功带绿色荧光的细胞形态无显著变化，继续培养，带绿色荧光的细胞开始分裂增殖（见图 2）。

图 2　荧光显微镜细胞观察图（scale bar＝ 100 μm）

Fig 2　Fluorescence microscope-observation ofcells（scale bar ＝ 100μm）

3.4　筛选单克隆细胞株

Rin-m5F细胞孵育转染溶液 24 h、更换新鲜完全培养基恢复培养 24 h、1 mg·mL －1 浓度的 G418 筛选培养 2 d 后，倒置荧光显微镜下观察未被转染的细胞基本全部死亡。降低 G418 浓度至 100 μg·mL －1 ，每3 日更换 1 次新鲜完全培养基，成功转染的细胞扩大培养 12 d，按照 10 倍稀释法消化细胞接种于 96 孔板，选取荧光强、分布均匀的单克隆细胞并扩大培养，倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察、拍照，结果见图 3。

图 3　Rin-m5F/ GLP1RGFP 单 克 隆 细 胞 观 察 图（scale bar＝ 200μm、10 μm）

Fig 3　Observation ofRin-m5F/ GLP1R-GFP monoclonal cells（scalebar＝ 200 μm、10 μm）

3.5　蛋白印记鉴定

以 Rin-m5F为空白对照，53 KD 处转染后获得的单克隆细胞株 Rin-m5F/GLP1R- GFP 中 GLP1R 表达量增加，结果见图 4。结果表明：GLP1R 已成功转染，并在单克隆细胞中稳定表达。

图 4　GLP1R 的表达

Fig 4　Expression of GLP1R

3.6　模型验证

单克隆细胞株 Rin-m5F/GLP1R-GFP 在不同条件下孵育，收样、制片，置于激光共聚焦下观察并拍照，结果见图 5 ～ 6。如图所见，溶剂对照组中细胞绿色荧光均匀分布，阴性对照组（非 GLPlR 靶点药物）中无明显荧光斑点，阳性对照组（GLPlR 激动剂药物）中细胞内出现明显的荧光斑点。

图 5　不同浓度药物处理细胞 1 h 结果（scale bar＝ 10 μm）Fig 5　Cells treated with different concentrations of drugs for 1 h（scalebar＝ 10 μm）

图 6　相同浓度药物处理细胞不同时间结果（scale bar＝ 10 μm）

Fig 6　Confocal fluorescence microscopy of cells（scale bar＝ 10 μm）

结果表明：绿色荧光标记的 GLPlR已经成功整合到 Rin-m5F中，并稳定表达。非 GLPlR靶点药物格列本脲处理组细胞内无明显荧光斑点，未能激活模型；GLPlR激动剂药物百泌达处理组细胞内绿色荧光明显聚集成荧光斑点，激活模型。因此该模型建立成功，能用于筛选 GLPlR激动剂类药物。

4、讨论

目前大部分以 GLPlR为靶点构建的高通量激动剂筛选模型的设计原理是根据 GLPlR信号途径的特点来设计，主要可以分为以下 3 个方面[15] ：① 基于受体与配体结合原理构建模型：荧光微体积测定技术、荧光偏振法；② 基于检测胞内第二信使 cAMP构建模型：竞争性酶联免疫吸附检测法、闪烁邻近测定法、载黑色素细胞测定法；③ 基于受体功能反应构建报告基因构建模型：陈家琪等[16]在 CHO细胞中稳定转染带有增强型789中南药学 2017 年 6 月 第 15 卷 第6 期　Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因和 GLP1R，殷菲等[17]利用 GLPlR和报告基因在 PC12 细胞中建立稳定的GLPlR激动剂筛选模型。这 3 个方面设计的筛选模型各有特色，受体——配体结合分析检测方法缺点是成本高且不能识别是配体是激动还是拮抗剂；检测 cAMP的筛选模型要求裂解细胞释放出胞内的 cAMP，且还需洗涤除去未结合的标记 cAMP；报告基因筛选模型常需要作用底物或者辅助因子，筛选成本高。本实验中选用 Rin-m5F作为宿主细胞是基于GLPlR 激动剂类药物治疗糖尿病的主要作用靶点位于胰岛细胞上，这样笔者的筛选模型能更加贴切反应药物治疗糖尿病时的生理机能。采用直接标记 GLPlR C端，使靶蛋白可视化，通过观察胞内荧光变化就能直观反应受体被激活，具有极大降低假阳性的优势。高内涵筛选平台是近年发展起来的新的筛选模式，通过采集荧光图像，综合运用高分辨率的荧光数码影像技术、数理统计分析方法等模板在单一实验中反应被测样品的生物活性、药代动力学性质和潜在毒性等。该筛选技术的优势在于所有的检测能在活细胞内进行，筛选速度快。本文建立的基于荧光标记使靶向蛋白可视化的原理，使该模型符合高内涵筛选平台的基本要求，为筛选 GLPlR 激动剂的高通量筛选奠定了坚实的基础。该模型能应用于混合物样品 GLP1 类似物小分子药物的筛选，具有假阳性极低、筛选所需样本小、筛选样品量大、易标准化、筛选速度快、特异性强等优势。同时这种研究模式为我国中药分子机制提供新的思路，为我国中药实现复方创新、早期评价、早期淘汰等目标提供便捷。参考文献[1] 中华医学会糖尿病学分会 . 中国 2 型糖尿病防治指南（2007 年版）[J]. 中华医学杂志，2008，88（18）：1227-1245.[2] LiuD，Darville M，Eizirik DL. Double-stranded ribonu-cleic acid（RNA）induces beta-cell Fas messenger RNAexpression and increases cytokine-induced beta-cell apopto-sis [J]. Endocrinology，2001，142（6）：2593-2599.[3] Liu D，Pavlovic D，Chen MC，et al. Cytokines induceapoptosis in beta-cells isolated from mice lacking the induc-ible isoform of nitric oxide synthase（iNOS-/-）[J]. Diabe-tes，2000，49（7）：1116-1122.[4] Muoio DM，Newgard CB. Mechanisms of disease：Mo-lecular and metabolic mechanisms of insulin resistance andbeta-cell failure in type 2 diabetes [J]. Nat Rev Mol CellBiol，2008，9（3）：193-205.[5] 钱荣立 . 关于糖尿病的新诊断标准与分型[J]. 中国糖尿病杂志，2000，8（1）：5-6.[6] 姚君厘，杨永年 . 糖尿病并发症感染及其危险因素分析[J]. 中华医院感染学杂志，1998，8（4）：216-218.[7] Bahtiyar G，Gutterman D，Lebovitz H. Heart failure：amajor cardiovascular complication of diabetes mellitus [J].Current Diabetes Reports，2016，16（11）：116-130.[8] Bril F，Cusi K. Nonalcoholic fatty liver disease：The newcomplication of type 2 diabetes mellitus [J]. Endocrinol Me-tab Clin North Am，2016，45（4）：765-781.[9] Bo AE. Islet G protein-coupled receptors as potential targetsfor treatment of type 2 diabetes [J]. Nature Reviews DrugDiscovery，2009，8（5）：369-385.[10] 闫荣，杨子义 . 胰高血糖素样肽 -1 类似物新药的研发进展[J]. 中国生物制品学杂志，2011，24（7）：866-868.[11] 毛黎静，安春红，张贝娜，等 . 新型糖尿病治疗药物的研究进展[J]. 中南药学，2017，15（1）：88-91.[12] 盛灵通，孔建龙，秦健，等 . GLP-1 及其类似物治疗糖尿病的研究进展[J]. 糖尿病新世界，2015，（2）：22-23.[13] Lai X，Kang X，Zeng L，et al. The protective effectsand genetic pathways of thorn grape seeds oil against highglucose-induced apoptosis in pancreatic  β -cells [J]. BMCComplem Altern M，2014，14（1）：10-17.[14] Wu Y，Wang X，Guo H，et al. Synthesis and screeningof 3-MA derivatives for autophagy inhibitors. [J]. Autopha-gy，2013，9（4）：595-603.[15] 许芳芳，王楠，李刚强，等 . 人胰高血糖素样肽 -1 的研究与应用进展[J]. 生物技术通报，2016，32（6）：30-37.[16] 陈家琪，高智慧，朱元元，等 . 重组胰高血糖素样肽 -1与人血清白蛋白融合蛋白的纯及活性研究[J]. 微生物学通报，2007，34（5）：871-874.[17] 殷菲，邓小红，景佳佳，等 . 胰高血糖素样肽 1 受体激动的高通量筛选及作用机制研究[J]. 中国药学杂志，2007，42（1）：24-27.

（收稿日期：2017-02-20；修回日期：2017-05-01）

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